Alternatif Prosedur Pengelolaan Sediaan Kulit Ikan Air Tawar

Teknik Nekropsi & Pengambilan Sampel Kulit

Setelah eutanasia, pengambilan sampel harus dilakukan secepat mungkin untuk mencegah autolisis.

Pengambilan Sampel

Lokasi Anatomi

Untuk standarisasi dan perbandingan, lokasi pengambilan sampel harus konsisten.

• Area dorsal-lateral.
• Tepat di bawah insersi sirip punggung.
• Di atas gurat sisi (gurat lateral).
• Memberikan representasi penuh dari semua lapisan kulit.

Penanganan Lendir (Kritis)

DILARANG

Jangan pernah mengikis, menyeka, atau menggosok permukaan kulit dengan kain kasa kering atau alat tumpul.

Hasil: Merobek & mengangkat seluruh epidermis.

DIREKOMENDASIKAN

Bilas area target secara perlahan dan lembut tanpa menyentuh kulit secara fisik.

Gunakan: Salin isotonik (0.9% NaCl)

Lebih Baik: Larutan fiksatif (10% NBF)

Eksisi dan Dimensi Kritis

Gunakan pisau bedah (scalpel) steril dengan mata pisau tajam.

Buat sayatan paralel dan tegak lurus untuk mengambil strip kulit persegi.

Ketebalan adalah faktor pembatas utama.

• Tebal: Optimal 3 mm (Maks 3 mm)
• Lateral: 10 mm x 10 mm

Peringatan: Sampel > 3 mm akan mengalami autolisis di bagian tengah. Formalin hanya menembus ~2 mm dalam 4 jam.

Protokol Fiksasi

Fiksasi adalah proses kimia yang mengawetkan morfologi jaringan dan menghentikan autolisis.

Rasio Volume Kritis (Fiksatif : Jaringan)

10:1 hingga 20:1

Memastikan konsentrasi fiksatif tidak berkurang oleh cairan jaringan.

Analisis Pilihan Fiksatif

Larutan Bouin (Standar)

Memberikan penetrasi lebih baik dan kualitas superior.

• "Gambaran histologis lebih jelas"
• "Resolusi tinggi"
• "Kenampakan sangat jelas"

Manfaat Tambahan: Bersifat asam, membantu dekalsifikasi parsial awal pada sisik.

10% NBF (Alternatif)

Fiksatif serba guna yang paling umum digunakan.

• "Resolusi sedang"
• "Kontras kurang" (dibanding Bouin)

Kelebihan: Stabil, mudah didapat, dan pilihan untuk Imunohistokimia (IHC).

Protokol Fiksasi Standar (Menggunakan Bouin)

1. 1

   Segera tempatkan sampel (maks 3 mm) ke dalam Larutan Bouin dengan rasio 1:20.

2. 2

   Biarkan fiksasi berlanjut selama 24 jam. Jangan melebihi 48 jam (jaringan bisa rapuh).

3. 3

   Pindahkan jaringan dari Bouin ke dalam Etanol 70% untuk penyimpanan atau lanjut ke dekalsifikasi.

Protokol Standar Dekalsifikasi EDTA

1. Persiapan Larutan

• Siapkan larutan EDTA 10% b/v dalam air deionisasi.
• Atur pH perlahan ke 7.4 menggunakan NaOH pekat.

Catatan: EDTA tidak akan larut sepenuhnya sampai pH mendekati 7.0.

2. Prosedur & Aturan Kritis

Setelah fiksasi (dan pembilasan singkat jika perlu), rendam kaset jaringan ke dalam larutan EDTA 10% (pH 7.4).

Volume Larutan

150x

Volume Jaringan

Menyediakan reservoir ion kelat yang cukup.

Penggantian Larutan

5-7 Hari

Setiap 5-7 Hari

Ganti larutan EDTA yang sudah jenuh.

Durasi

2-3 Minggu

Bervariasi

Agitasi (pengadukan) lembut dapat mempercepat.

3. Pemantauan Titik Akhir (Endpoint)

Penting: Hindari Over-Decalcification

Dapat merusak pewarnaan, meskipun EDTA jauh lebih aman daripada asam.

Metode Fisik (Direkomendasikan)

• Keluarkan sampel secara berkala (misalnya, setiap 5 hari).
• Periksa kelunakan: Tusuk jaringan dengan jarum halus.

Selesai Jika: Jarum masuk tanpa resistensi (tanpa "bunyi kerikil").

Metode Radiografi

• Metode paling akurat.
• Menggunakan rontgen (X-ray).

Tujuan: Memvisualisasikan hilangnya mineral.

Jadwal Pemrosesan Jaringan Standar Kulit Ikan

Protokol adaptasi untuk histopatologi ikan air tawar.

Fase 1: Dehidrasi (Penghilangan Air)

Tujuan utama dari fase ini adalah untuk mengeluarkan semua molekul air dari dalam sampel jaringan kulit ikan, karena air tidak dapat bercampur dengan parafin.

Langkah 1 & 2: Alkohol 70%

Durasi: 2 Sesi @ 1 Jam / Sesi

Tujuan dari langkah awal ini adalah untuk memulai penggantian air di dalam jaringan secara bertahap dengan alkohol.

Langkah 3 & 4: Alkohol 95%

Durasi: 2 Sesi @ 1 Jam / Sesi

Jaringan dipindahkan ke larutan dengan konsentrasi alkohol yang lebih tinggi untuk melanjutkan proses dehidrasi.

Langkah 5 & 6: Alkohol 100%

Durasi: 2 Sesi @ 1 Jam / Sesi

Memastikan semua sisa air benar-benar hilang dan penghilangan air sepenuhnya dari jaringan tercapai.

Fase 2: Clearing (Penjernihan)

Alkohol (yang juga tidak larut dalam parafin) harus digantikan dengan reagen yang dapat larut dalam alkohol sekaligus parafin.

Langkah 7 & 8: Xilena (Xylol)

Durasi: 2 Sesi @ 1 Jam / Sesi

Reagen Xilena digunakan untuk mengganti alkohol absolut yang ada di dalam jaringan sebelum diisi parafin.

Fase 3: Infiltrasi (Pengisian Parafin)

Tahap akhir di mana jaringan yang sudah jernih akan diisi penuh dengan parafin cair untuk memberikan dukungan struktural.

Langkah 9: Parafin Cair (65°C)

Durasi: 1 Sesi @ 1 Jam

Perendaman pertama dalam parafin cair dengan tujuan utama untuk mengganti xilena dengan parafin.

Langkah 10: Parafin Cair (65°C)

Durasi: 1 Sesi @ 1 Jam

Pengulangan proses untuk memastikan infiltrasi parafin yang menyeluruh ke dalam seluruh bagian jaringan.

Catatan Penting!

Segera setelah langkah 10 (infiltrasi parafin kedua) selesai, jaringan tersebut harus segera dilanjutkan ke tahap embedding (penanaman). Jaringan tidak boleh dibiarkan mendingin di luar blok parafin.

Prosedur Embedding "On Edge"

Langkah demi langkah untuk orientasi presisi sampel kulit.

1. Persiapan Stasiun

Siapkan Embedding Center (stasiun penanaman) dengan parafin cair (sekitar 65°C) dan Cold Plate.29

2. Siapkan Cetakan

Pilih Cetakan (stainless base mold) dengan ukuran yang sesuai. Isi cetakan dengan parafin cair.30

3. Ambil Sampel Kulit

Buka kaset pemrosesan. Gunakan Pinset Hangat (penting untuk mencegah parafin beku di pinset)28 untuk mengambil sampel kulit yang telah terinfiltrasi.

4. Pindahkan Sampel

Pindahkan sampel kulit ke dalam cetakan yang telah berisi parafin cair.

5. Orientasi Presisi

Dengan pinset hangat, posisikan sampel sehingga berdiri "On Edge" (Vertikal) di dasar cetakan.28

6. Orientasi Pisau (Best Practice)

Orientasikan agar pisau mikrotom mengenai Jaringan Padat (Dermis) terlebih dahulu, baru Jaringan Rapuh (Epidermis).26 Ini mencegah epidermis terlipat atau robek.

7. "Glueing" (Perekatan)

Letakkan cetakan di Cold Plate beberapa detik hingga dasar parafin membeku ("merekatkan" sampel), sambil tetap dipegang pinset.28

8. Pasang Kaset

Setelah sampel stabil, tempatkan bagian Kaset (berlabel) di atas cetakan. Tambahkan parafin cair jika perlu hingga penuh.

9. Pembekuan Penuh

Pindahkan seluruh unit (cetakan dan kaset) ke Cold Plate hingga benar-benar padat (sekitar 20 menit atau lebih).30

10. Blok Selesai

Setelah padat, lepaskan Blok Parafin (sampel yang tertanam di kaset) dari cetakan logam. Blok siap untuk dipotong.

Prosedur Mikrotomi Jaringan Parafin

1. Persiapan Blok

• Blok parafin jaringan didinginkan merata di nampan es/cold plate.
• Durasi pendinginan: minimal 15-30 menit.
• Lakukan trimming (pemangkasan) blok untuk membuang kelebihan parafin dan mengekspos tepi jaringan.

2. Pengaturan Mikrotom Putar

• Jepit blok parafin dengan aman ke dalam holder mikrotom.
• Pasang pisau mikrotom sekali pakai yang baru, bersih, dan berkualitas tinggi.
• Atur sudut kemiringan pisau (knife tilt angle) sesuai rekomendasi pabrikan.
• Atur ketebalan irisan untuk H&E kulit ikan: 5 µm (mikrometer).

3. Teknik Ribboning (Pembuatan Pita)

• Lakukan pemotongan "kasar" (roughing) pada ketebalan 15-20 µm hingga seluruh permukaan jaringan terlihat.
• Atur kembali ketebalan ke 5 µm.
• Potong irisan dengan putaran roda yang stabil dan konsisten untuk membentuk pita (ribbon).
• Gunakan kuas halus atau pinset untuk memandu pita menjauh dari blok.

4. Floating (di Water Bath)

• Pindahkan pita (ribbon) irisan yang lurus dan bebas kerutan ke water bath (penangas air) yang bersih.
• Suhu water bath: diatur sekitar 42°C.
• Tujuan: Merelaksasi dan menghilangkan kerutan pada irisan tanpa melelehkan jaringan.

5. Penempelan (Affixing)

• Pisahkan irisan yang diinginkan pada pita menggunakan pinset.
• Ambil irisan dari bawah permukaan air menggunakan kaca objek (slide) bersih berperekat.
• Angkat slide secara vertikal agar air mengalir habis.
• Tempatkan slide di slide warmer (42°C - 60°C) atau dalam oven semalaman untuk menguapkan air dan melekatkan jaringan.