3. HASIL PENELITIAN
MISTERI TROMBOSIT & VIRUS PUUV
Disfungsi Sel, Gumpalan Darah, & Fase Akut HFRS
3.1. DISFUNGSI TROMBOSIT & INTERAKSI SEL
Penyakit HFRS yang dipicu oleh virus PUUV berkaitan dengan disfungsi trombosit dan terganggunya interaksi antara trombosit dengan sel darah putih (leukosit).
Untuk menyelidiki dampak infeksi virus PUUV terhadap fungsi trombosit dalam menghentikan perdarahan (hemostatik) dan kemampuannya mengatur sistem imun (imunomodulatori), para peneliti secara berencana membandingkan seberapa baik trombosit merespons dan seberapa baik pembentukan gumpalan antara trombosit dan sel darah putih (Agregat Trombosit-Leukosit/PLA). Perbandingan ini dilakukan pada empat pasien HFRS yang datang berobat ke Rumah Sakit Universitas Umeå, dibandingkan dengan darah dari pendonor yang sehat (Gambar 1A). Tulisan ini dimuat dalam jurnal medis Thrombosis Research volume 233 tahun 2024 halaman 41-54.
Analisis terhadap protein VASP (penanda yang menunjukkan hambatan kerja trombosit di dalam sel) tidak menunjukkan adanya perbedaan jika dibandingkan dengan orang sehat (Gambar 1B). Namun, para pasien HFRS menunjukkan penurunan kemampuan trombosit untuk bereaksi selama fase akut (fase awal yang parah). Penurunan reaksi ini memengaruhi kemampuan trombosit untuk mengeluarkan zat pembeku darah (degranulasi) dan memengaruhi aktifnya penerima sinyal pembekuan darah (reseptor fibrinogen GPIIb/IIIa) di permukaan sel (Gambar 1C).
Sejalan dengan kemampuan respons trombosit yang lemah tersebut, para pasien PUUV-HFRS juga menunjukkan gangguan dalam pembentukan gumpalan antara trombosit dengan berbagai jenis sel darah putih di dalam aliran darah, seperti sel neutrofil, sel T, dan sel B (Gambar 1D). Gangguan ini dapat membatasi kemampuan trombosit dalam membantu mengatur sistem kekebalan tubuh.
Perlu dicatat bahwa, meskipun penanda keaktifan (CD11b) pada sel neutrofil tidak berubah, sel darah putih jenis monosit justru menunjukkan kecenderungan untuk lebih aktif dan menghasilkan Faktor Jaringan (TF) secara nyata lebih banyak dibandingkan orang sehat (Gambar 1E-F). Hal ini bisa berkontribusi menciptakan lingkungan di dalam tubuh yang terlalu mudah membekukan darah (prokoagulan) pada pasien HFRS.
3.2. MISTERI TROMBOSITOPENIA & KADAR CXCL4
Kondisi jumlah trombosit yang rendah (Trombositopenia) pada pasien PUUV-HFRS tidak berkaitan dengan pelepasan penanda aktivasi trombosit ke dalam darah.
Selanjutnya, peneliti ingin memastikan apakah jumlah trombosit yang merosot pada penyakit HFRS ada hubungannya dengan kondisi trombosit yang diam-diam terlalu aktif bekerja, sehingga akhirnya trombosit tersebut menumpuk (sekuestrasi) dan kelelahan lalu habis. Oleh karena itu, peneliti meninjau kembali data masa lalu (retrospektif) untuk melihat hubungan antara jumlah trombosit, jumlah virus dalam tubuh, dan kadar protein CXCL4 dari waktu ke waktu pada kelompok pasien PUUV-HFRS yang mengalami penurunan trombosit parah selama fase akut (Gambar 2A).
Titik paling rendah jumlah trombosit (nadir) terjadi di sekitar waktu pasien masuk ke dalam penelitian, yakni dengan nilai tengah pada hari ke-5 setelah gejala pertama muncul. Setelah itu, tubuh berusaha memperbaiki keadaan sehingga jumlah trombosit kembali naik perlahan, sebelum akhirnya kembali stabil di angka normal setelah sakit sekitar 3 minggu (Gambar 2B). Meskipun keberadaan virus di dalam darah (viremia) sangat umum terjadi saat pasien baru masuk rumah sakit (86,1%), kondisi ini jarang bertahan lebih dari 14 hari (Gambar 2C) dan terbukti hanya memiliki hubungan yang sangat lemah dengan jumlah trombosit (Gambar Tambahan 4A).
Para peneliti juga mengukur kadar protein CXCL4 di dalam cairan plasma darah. Protein ini digunakan sebagai penanda tidak langsung yang sangat peka untuk melihat apakah trombosit diam-diam sedang aktif. Secara umum, pergerakan kadar CXCL4 ternyata sangat mirip dengan jumlah trombosit. Kadarnya terlihat lebih rendah selama fase penyakit akut dibandingkan saat pasien sudah dalam masa pemulihan (Gambar 1D).
CXCL4 hanya memiliki korelasi atau hubungan yang lemah dengan jumlah trombosit. Ketika dihitung secara berimbang dengan jumlah trombosit, kadar CXCL4 menunjukkan sangat sedikit perubahan di sepanjang perjalanan penyakit (Gambar Tambahan 4B-C). Berbagai pengamatan ini bertentangan dengan gagasan awal yang mengira bahwa trombosit diam-diam bekerja (aktivasi laten) adalah penyebab di balik turunnya angka trombosit dan rusaknya fungsi trombosit pada penderita PUUV-HFRS.
Peneliti selanjutnya melakukan pengujian untuk melihat apakah ada suatu "faktor penghambat" di dalam cairan darah (plasma) pasien HFRS fase akut. Caranya dengan menganalisis bagaimana respons trombosit dari orang sehat yang belum pernah terpapar (naif) ketika dicampur ke dalam cairan plasma darah milik pasien (Gambar 2E). Namun, ternyata trombosit sehat tersebut tetap dapat aktif seperti biasa... (Bersambung ke halaman berikutnya)... baik saat berada di dalam plasma pasien yang diambil pada hari ke-4 saat fase akut, maupun plasma dari fase pemulihan. Hal ini membuktikan bahwa respons trombosit yang lemah pada penyakit PUUV-HFRS akut murni disebabkan oleh kerusakan dari dalam sel trombosit itu sendiri, bukan karena pengaruh dari cairan plasma di sekitarnya.
ANALISIS KLINIS & STATISTIK
HASIL UJI LAB & GRAFIK PENYAKIT
Pembuktian Pola Pemulihan Pasien HFRS
HASIL UJI LABORATORIUM PASIEN PROSPEKTIF (TABEL 2)
Tabel 2 menjabarkan parameter laboratorium dari 4 pasien PUUV-HFRS yang diteliti secara langsung. Kadar Hemoglobin (dengan rentang rujukan normal 11,7-15,3 g/dL untuk wanita, dan 13,4-17,0 g/dL untuk pria) memiliki nilai tengah 11,7 g/dL saat awal masuk rumah sakit (rentang 11,1-12,0 g/dL).
Kadar ini meningkat pada masa pemulihan menjadi 14,0 g/dL (rentang 14,0-14,4 g/dL), dengan nilai uji statistik p tertulis 90,2500 (kemungkinan terdapat kesalahan penulisan angka pada sumber asli, karena nilai p umumnya berada di bawah angka 1).
Jumlah trombosit (normal 145-348 × 109/L) rendah saat masuk, yakni bermedian 231 (rentang 94-378), dan membaik saat pulih menjadi 259 (rentang 203-295), dengan nilai p=0.6250. Jumlah sel darah putih (leukosit) dengan rentang normal 3.5-8.8 × 109/L adalah 7,2 saat masuk, dan turun ke angka 4,8 saat pemulihan, dengan nilai p=0.1250.
Jumlah sel limfosit (normal 1.0-3.5 × 109/L) adalah 1,6 saat masuk dan menjadi 1,8 saat pulih (p=0.8750). Jumlah sel neutrofil (normal 1.8-6.3 × 109/L) adalah 4,4 saat masuk dan 3,4 saat pulih (p=0.8750). Jumlah sel monosit (normal 0.3-1.2 × 109/L) adalah 0,8 saat masuk dan 0,5 saat pulih (p=0.2500).
Waktu kecepatan pembekuan darah (Activated partial thromboplastin time) sedikit melambat dengan nilai 28,3 detik saat awal masuk (normal 24,0-36,0 detik), lalu menjadi 26,9 detik saat pulih (p=0.3750).
INDIKATOR PERADANGAN & PEMBEKUAN
Kadar protein C-reaktif atau CRP (penanda peradangan, normal <3 mg/L) sangat tinggi saat awal masuk dengan nilai 29 mg/L (rentang 1-42) dan turun kembali normal saat pulih yakni di bawah 3 mg/L (p=0.2500).
Dari pengelompokannya, saat masuk ada 1 pasien (25,0%) yang kadar CRP-nya normal, dan 3 pasien (75,0%) mengalami peningkatan sedang (>10-100 mg/L). Saat masa pemulihan, 2 pasien (50,0%) kembali normal, dan 2 pasien (50,0%) mengalami peningkatan ringan (3-10 mg/L) (p=0.0695). Tidak ada pasien yang peradangannya sangat parah atau ditandai sebagai peningkatan tajam (>100 mg/L).
Kadar D-dimer (penanda pembekuan darah abnormal, normal <0.20 mg/L) meningkat saat masuk dengan angka 0,29, dan kembali normal saat pulih (<0.05-0.06). Klasifikasinya menunjukkan saat masuk 3 pasien (75,0%) memiliki D-dimer tinggi dan 1 pasien (25,0%) normal. Saat pulih, kedua pasien yang diuji (100,0%) menunjukkan nilai normal (p=0.0833).
Pengujian data ini menggunakan alat ukur statistik yang disebut Wilcoxon matched-pairs signed rank test yang tidak bisa digunakan jika jumlah data di bawah tiga (n<3), atau menggunakan Chi-square test. Data dengan jumlah subjek terlalu sedikit atau data yang kualitasnya tidak beraturan tidak memungkinkan perhitungan nilai p atau nilai tengah. Angka 44 adalah nomor halaman pada dokumen ini.
PENJELASAN GRAFIK PERJALANAN PENYAKIT (GAMBAR 2)
Jurnal Penelitian Trombosis Volume 233 (Tahun 2024) Halaman 41-54 oleh W.C. Schrottmaier menyajikan Gambar 2 yang membuktikan bahwa turunnya jumlah trombosit akibat infeksi virus Puumala (PUUV) pada penyakit HFRS tidak disebabkan oleh aktivitas trombosit yang tersembunyi.
Grafik bagian atas (Gambar 2A) menunjukkan alur percobaan: pasien penderita PUUV-HFRS yang datang ke Rumah Sakit Universitas Umeå, Swedia, dan memiliki jumlah trombosit rendah pada saat awal pemeriksaan, dipantau secara medis. Cairan bening darah mereka (serum dan plasma) diambil dari hari pertama gejala muncul (Hari ke-0), hari awal penelitian (Hari ke-5), hingga fase pemulihan yang berjarak lebih dari 42 hari (Hari ≥42).
Tiga hal yang diukur meliputi jumlah trombosit dari 42 pasien, jumlah virus (viral load) dari 36 pasien, dan kadar molekul CXCL4 dalam plasma dari 33 pasien. Selain itu, kemampuan trombosit untuk menjadi aktif juga diukur dari sampel 4 orang pendonor darah sehat (HD) yang dicampur ke dalam cairan pasien dari fase akut dan pemulihan, lalu ditambahkan zat perangsang berupa ADP (Adenosina difosfat).
POLA TROMBOSIT, VIRUS, & KADAR CXCL4
Grafik 2B menjabarkan perubahan jumlah trombosit (dalam hitungan x 103/μL) selama pasien sakit. Garis abu-abu menggambarkan kondisi masing-masing pasien, sementara garis bersambung ungu tebal adalah nilai rata-rata dari ke-42 pasien. Dari hari ke-0 hingga hari ke-7, jumlah trombosit berada di titik yang sangat rendah, jauh di bawah kotak abu-abu yang merupakan batas normal (garis bawah batas normal adalah angka 145). Setelah hari ke-7, jumlah trombosit berangsur naik dengan sangat cepat hingga puncaknya melewati batas normal atas pada sekitar hari ke-14 hingga ke-21. Setelah itu, jumlah trombosit kembali stabil dan mendatar di dalam kotak wilayah normal hingga melewati masa pemulihan (hari ≥42).
Grafik 2C memperlihatkan perubahan jumlah virus (viral load) dalam hitungan kopi per mililiter pada 36 pasien. Pada hari-hari awal gejala (hari ke-0 hingga ke-7), jumlah virus sangat tinggi mencapai rentang 104 hingga 105 kopi/mL. Namun dengan cepat, jumlah virus tersebut menukik tajam ke bawah dan hilang sepenuhnya hingga mendekati angka nol pada rentang hari ke-14 hingga hari ke-28.
Grafik 2D menunjukkan tingkat kadar protein CXCL4 di dalam plasma. Grafik ini memperlihatkan pola yang menyerupai pola jumlah trombosit. Di minggu pertama (hari ke-0 hingga hari ke-7), kadar CXCL4 sangat rendah di bawah 5 ng/mL. Kemudian kadarnya merangkak naik dan memuncak sekitar 10 ng/mL pada hari ke-14 hingga ke-21, lalu secara bertahap turun melandai dengan stabil di sekitar angka 5 ng/mL pada fase penyembuhan.
UJI AKTIVASI DENGAN ZAT ADP
Grafik batang 2E membandingkan tingkat aktifnya sel trombosit, yang dilihat dari protein CD62P di permukaan selnya, setelah dicampur cairan plasma pasien saat fase akut (warna ungu) dan fase pemulihan (warna merah muda). Ketika hanya diberi cairan garam biasa (PBS), tingkat keaktifan trombosit dari kedua fase tersebut sangat rendah (di bawah angka 50).
Akan tetapi, setelah diberi zat perangsang ADP, trombosit pada plasma fase akut maupun fase penyembuhan sama-sama bisa bereaksi dan melonjak aktif mencapai angka di kisaran 50 hingga 100. Hal ini membuktikan kemampuan dasar trombosit sebenarnya masih berfungsi dengan baik.
