Tujuan:
- Mahasiswa mampu melakukan kultur akar bawang merah dengan benar untuk mendapatkan ujung akar yang mengandung sel-sel aktif membelah.
- Mahasiswa mampu memilih ujung akar yang sesuai untuk pembuatan sediaan mikroskopis kromosom.
- Mahasiswa memahami prinsip pengelolaan akar bawang merah selama proses kultur untuk hasil yang optimal.
Materi dan Alat:
- Umbi bawang merah (pilih yang segar, tidak bertunas hijau panjang atau busuk)
- Gelas beaker atau botol berleher sempit
- Air bersih (sebaiknya air suling atau air keran yang sudah diendapkan semalam)
- Kertas tisu atau kain lap
- Pinset
- Silet atau pisau bedah tajam
- Kaca objek bersih
- Kaca penutup bersih
- Pipet tetes
- Larutan fiksatif Carnoy (etanol absolut : asam asetat glasial = 3:1)
- Air suling
- Larutan HCl 1N (hati-hati dalam penanganan asam kuat)
- Larutan pewarna Orcein Asetat 2% (atau pewarna lain yang sesuai)
- Mikroskop cahaya
- Minyak imersi (jika menggunakan lensa objektif 100x)
- Buku catatan atau lembar kerja praktikum
Prosedur Kerja:
Tahap I: Penumbuhan Akar Bawang Merah (± 2-3 Hari)
- Pemilihan Umbi: Pilih umbi bawang merah yang sehat, berukuran sedang, tidak menunjukkan tanda-tanda kerusakan fisik, tidak bertunas hijau panjang (tunas kecil ± 0.5 cm masih dapat diterima), dan tidak busuk atau berjamur.
- Persiapan Wadah: Isi gelas beaker atau botol berleher sempit dengan air bersih hingga ketinggian yang cukup agar hanya bagian dasar umbi bawang merah yang terendam air.
- Penempatan Umbi: Letakkan umbi bawang merah di atas mulut gelas/botol sedemikian rupa sehingga bagian dasarnya (tempat akar akan tumbuh) menyentuh permukaan air. Pastikan bagian atas umbi tetap kering. Anda dapat menggunakan tusuk gigi yang ditancapkan di sisi umbi sebagai penyangga jika diperlukan.
- Inkubasi: Letakkan wadah berisi umbi di tempat yang gelap atau teduh dan bersuhu ruangan (sekitar 20-25°C). Hindari paparan sinar matahari langsung atau suhu ekstrem.
- Penggantian Air: Ganti air dalam wadah setiap hari untuk menjaga kebersihan dan mencegah pertumbuhan bakteri atau jamur yang dapat menghambat pertumbuhan akar. Perhatikan juga volume air, pastikan bagian dasar umbi tetap terendam.
- Pengamatan Pertumbuhan Akar: Amati pertumbuhan akar setiap hari. Akar yang baik untuk digunakan dalam praktikum ini adalah akar yang masih muda, berwarna putih atau kekuningan, dan memiliki panjang sekitar 1-3 cm. Akar yang terlalu panjang atau berwarna cokelat biasanya sudah mengalami diferensiasi sel dan memiliki lebih sedikit sel yang aktif membelah di ujungnya.
Pengelolaan Selama Kultur:
- Kebersihan Air: Air yang kotor dapat menghambat pertumbuhan akar dan memicu pertumbuhan mikroorganisme kontaminan. Penggantian air harian sangat penting.
- Suhu: Suhu yang terlalu tinggi atau terlalu rendah dapat mempengaruhi laju pertumbuhan akar dan pembelahan sel. Pertahankan suhu ruangan yang stabil.
- Cahaya: Hindari paparan cahaya langsung yang berlebihan. Kegelapan atau kondisi teduh umumnya lebih baik untuk pertumbuhan akar awal.
- Kelembaban: Kelembaban lingkungan yang terlalu rendah dapat menyebabkan penguapan air yang cepat dan mempengaruhi kondisi umbi.
- Penanganan Umbi: Hindari memindahkan umbi terlalu sering atau dengan kasar, karena dapat merusak calon akar yang baru tumbuh.
Tahap II: Pemilihan dan Pengambilan Ujung Akar (Pra-Analitik)
- Seleksi Akar: Pilih beberapa akar yang sehat, lurus, dan memiliki panjang ideal (1-3 cm). Hindari akar yang bercabang terlalu banyak, rusak, atau berwarna cokelat.
- Pemotongan Ujung Akar: Dengan menggunakan silet atau pisau bedah yang tajam dan bersih, potong ujung akar sepanjang ± 1-2 mm dari bagian paling ujung (meristem apikal). Bagian ini adalah zona pembelahan sel aktif. Buang bagian akar yang lebih tua (di atas 2 mm dari ujung).
- Fiksasi: Segera setelah pemotongan, masukkan ujung-ujung akar ke dalam vial atau wadah yang berisi larutan fiksatif Carnoy (etanol absolut : asam asetat glasial = 3:1) dengan volume yang cukup untuk merendam seluruh ujung akar.
- Waktu Fiksasi: Biarkan ujung akar terendam dalam larutan fiksatif selama minimal 24 jam pada suhu ruangan. Fiksasi yang optimal akan mempertahankan struktur kromosom dengan baik.
- Penyimpanan (Jika Tidak Segera Diproses): Ujung akar yang telah difiksasi dapat disimpan dalam fiksatif yang sama di lemari pendingin (4°C) untuk beberapa waktu jika tidak segera diproses lebih lanjut.
Pengendalian Faktor Pemilihan dan Pengambilan:
- Ketajaman Alat Potong: Gunakan silet atau pisau bedah yang sangat tajam untuk mendapatkan potongan yang bersih dan meminimalkan kerusakan pada jaringan.
- Ketepatan Pemotongan: Pastikan hanya ujung akar (1-2 mm) yang diambil, karena bagian ini kaya akan sel-sel yang aktif membelah.
- Kecepatan Fiksasi: Transfer ujung akar ke dalam larutan fiksatif sesegera mungkin setelah pemotongan untuk menghentikan proses seluler dengan cepat dan mencegah artefak.
- Volume Fiksatif: Gunakan volume fiksatif yang cukup untuk memastikan seluruh ujung akar terendam sempurna.
Tahap III: Pembuatan Sediaan Mikroskopis (Analitik)
Lanjutkan dengan langkah-langkah maserasi, pencucian, pewarnaan, dan pembuatan sediaan squash seperti yang telah dijelaskan pada panduan sebelumnya. Pastikan setiap langkah dilakukan dengan hati-hati dan sesuai dengan protokol yang berlaku.
Pengendalian Faktor Analitik (Fokus pada Akar Bawang Merah):
- Waktu Maserasi dengan HCl: Waktu maserasi dengan HCl perlu dioptimalkan. Untuk ujung akar bawang merah, waktu 5-8 menit dengan HCl 1N pada suhu ruangan biasanya cukup untuk melunakkan jaringan tanpa merusak kromosom. Amati tekstur ujung akar setelah maserasi; seharusnya terasa lunak saat disentuh dengan pinset.
- Kualitas Pewarna Orcein Asetat: Pastikan larutan Orcein Asetat 2% masih berwarna merah keunguan pekat. Larutan yang sudah pudar atau mengendap mungkin tidak memberikan pewarnaan yang optimal. Saring larutan pewarna sebelum digunakan jika terdapat endapan.
- Waktu Pewarnaan dengan Orcein Asetat: Waktu pewarnaan untuk ujung akar bawang merah biasanya berkisar antara 15-30 menit. Periksa intensitas warna ujung akar secara visual. Pewarnaan yang baik akan menghasilkan warna merah keunguan yang jelas pada inti sel dan kromosom.
- Teknik Squash: Saat menekan kaca penutup, lakukan secara perlahan dan merata. Hindari menggeser kaca penutup yang dapat merusak susunan kromosom. Tekan dengan kekuatan yang cukup untuk menyebarkan sel-sel tanpa menghancurkan kromosom.
Tahap IV: Pengamatan dan Interpretasi Hasil (Pasca-Analitik)
Lakukan pengamatan di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran yang sesuai. Identifikasi sel-sel pada tahap metafase, hitung jumlah kromosom, dan amati morfologi kromosom (ukuran dan posisi sentromer). Dokumentasikan hasil pengamatan Anda.
Pengendalian Faktor Pasca-Analitik (Fokus pada Akar Bawang Merah):
- Fokus Mikroskop: Pastikan fokus mikroskop diatur dengan baik untuk mendapatkan gambar kromosom yang jelas dan tajam.
- Identifikasi Kromosom Bawang Merah: Ketahui jumlah kromosom diploid normal bawang merah (Allium cepa), yaitu 2n = 16. Gunakan informasi ini sebagai pembanding saat menghitung jumlah kromosom pada sediaan Anda.
- Pengamatan Morfologi: Perhatikan ukuran relatif kromosom dan perkiraan posisi sentromer (meskipun pita kromosom tidak terlihat jelas dengan pewarnaan Orcein Asetat).
Keselamatan Kerja:
- Gunakan sarung tangan dan jas laboratorium selama bekerja dengan bahan kimia seperti fiksatif Carnoy dan larutan HCl.
- Bekerja di area yang通风 baik saat menggunakan fiksatif Carnoy (mengandung etanol dan asam asetat yang mudah menguap).
- Buang limbah bahan kimia sesuai dengan prosedur yang berlaku di laboratorium.
- Berhati-hati saat menggunakan silet atau pisau bedah tajam.
Dengan mengikuti panduan praktikum ini secara seksama dan memperhatikan pengendalian faktor-faktor pra-analitik, analitik, dan pasca-analitik, mahasiswa Teknologi Laboratorium Medik diharapkan dapat berhasil melakukan kultur akar bawang merah dan mengamati kromosom dengan mikroskop cahaya biasa, serta memahami prinsip-prinsip dasar sitogenetika. Selamat bekerja!
